ELECTROFOREZA PROTEINELOR-PE HARTIE

Generalitati:
Electroforeza este procedeul de separare a compusilor dizolvati sau suspendati in lichide pe baza vitezelor diferite de migrare a acestora intr-un camp electric .
Unii compusi macromoleculari cum sunt si proteinele au proprietatea de a fixa ioni la suprafata moleculelor lor .Numarul ionilor pozitivi sau negativi este functie de natura macromoleculei , de pH-ul si taria ionica a mediului.
Electroforeza pe hartie este folosita ca metoda analitica si micropreparativa si datorita avantajelor pe care le prezinta , se raspandeste pe scara din ce in ce mai mare.Electroforeza pe hartie este folosita in special in chimia aminoacizilor, peptidelor proteinelor,zaharurilor si componentelor acizilor nucleici.

Principiul electroforezei proteinelor: Moleculele proteinelor dizolvate in solutie tampon se gasesc in stare ionizata .Daca solutia este plasata intr-un camp electric , macroionii proteici migreaza catre polul de semn opus , cu viteze ce depind de sarcina lor electrica.Electroforeza proteinelor se efectueaza pe un suport inert , solid (hartie, acetat de celuloza s.a.) sau semisolid (gel de poliacrilamida, agaroza, agar sau amidon).

Electroforeza pe hartie a proteinelor
Conditii de lucru:

Separarea fractiunilor proteice se poate face prin varianta migrarii lente cu durata de 16-18 ore , sau a migrarii rapide in numai 4-5 ore.Acestea sunt determinate de conditiile de lucru , referitoare la forta ionica a solutiilor tampon, tensiunea la borne si intensitatea curentului.
Rezultate mai bune , concretizate intr-o separare clara si o dispresie mai larga a fractiunilor se obtin prin varianta migrarii lente .Cu toate acestea , pentru lucrarile practice este de preferat varianta migrarii rapide, incadrandu-se mai bine in timpul prevazut unei sedinte de laborator.






Reactivi si ustensile :
• Solutie tampon (solutii stoc) pH 8.6 , =0.1 , obtinuta astfel: 3.68 g acid dietilbarbituric (veronal) si 20.6 g dietilbarbiturat de sodiu (medinal, veronal sodic) se dizolva incet in 1000 ml apa distilata , eventual prin incalzire pe baie de apa la 80-90 , urmata de racire. Se pastreaza la frigider , pentru prevenirea contaminarii cu bacterii.
• Solutie tampon pH 8.6 ,  =0.033 (solutie de lucru) pentru migrarea rapida , care se obtine prin amestecarea unei parti apa distilata cu doua parti solutie stoc(in volume).
• Solutie pentru colorare : 1 g amidoschwartz 10 B se dizolva intr-un amestec de 90 mL acid acetic glacial , apoi se filtreaza pe filtru cutat.
• Solutii de spalare: solutie de acid acetic glacial 5% in apa distilata.
• Solutie de eluare , obtinuta prin amestecarea in volume egale a unei solutii de carbonat de sodiu 10% si metanol. Pentru a evita precipitarea , metanolul se adauga in portiuni mici, sub agitare.
• Proba de analizat-ser sanguin
• Hartie cromatografica Whatman nr. 1 (sau nr.4) sau Schleicher Schull nr. 2043 B.


Aparatura:
• Redresor pentru transformarea curentului alternativ in curent continuu.
• Cuva de electroforeza (camera umeda)-un dispozitiv paralilipipedic,de masa plastica, prevazut in interior cu doua compartimente paralele despartite intre ele.La unul din capetele fiecarui compartiment este fixat cate un electrod de platina, in asa fel ca ambii electrozi ai cuvei sa se afle pe diagonala.Din constructie ,cuva are un mic canal la partea superioara –canal de egalizare- care uneste compartimentele la unul din capete.Cuva mai este prevazuta cu un cadru de extensie a benzilor si un capac cu dop de cauciuc.Aceasta piesa principala a aparatului poate avea dimensiuni,forme si detalii de constructie diferite , stabilite de firma producatoare , insa principiulgeneral de functionareramane acelasi.
• Tavi de colorare si tavi de spalare
• Pulverizator
• Etuva electricareglabila la 110 grade.
Modul de lucru:
In cele doua compartimente ale cuvei de electroforeza se introduce solutia tampon, astfel incat , partea spiralata a electrozilor sa fie acoperita cu lichid insa suprafata lichidului sa nu ajunga la nivelul canalului de egalizare.
Cuva se aranjeaza intr-o pozitie perfect orizontala apoi se inclina cu grija , spre canalul de egalizare.Cand lichidul comunica prin canal, cuva se tine in aceasta pozitie, pentru egalizarea nivelului in ambele compartimente,dupa care se readuce incet , in pozitia orizontala, initiala.Canalul de egalizare se sterge cu hartie de filtru.In caz contrar, lichidul aderent permite trecerea curentului electric intre compartimente.
Pregatirea benzilor: Tinand seama de directia de migrare, se decupeaza din hartia de filtru un numar de benzi avand dimensiunile 30cm *2.5cm.In acest caz, o banda va fi pentru amestecul de proteine si cate una pentru fiecareproteina standard martor.


La mijlocul fiecarei benzi se traseaza cu creionul bine ascutit ,o linie subtire , perpendiculara pe laturile lungi.Benzile se umecteaza cu solutie tampon si se aseaza pentru scurt timp pe o hartie de filtru ordinara.In felul acesta, surplusul de solutie tampon- care ar putea produce perturbatii in procesul separarii-este indepartat.Benzile se aseaza cu grija prin adeziune pe cadrul de extensie, in pozitie perfect orizontala si perpendiculara pe axa lunga a acestuia.
Cadrul de extensie se introduce in cuva si odata cu el , capetele benzilor de hartie patrund in solutia tampon din compartimente.Se ataseaza capacul pentru etansare si se conecteaza cuva lla bornele redresorului, cu respectarea semnelor indicate pe fisa si stecher.Fara a veni in contact cu cuva de electroforeza se conecteaza redresorul la reteua de curent alternativ.De la butonul de pornire se da drumul curentului prin aparat, ajustandu-l prin butonul de reglare, la 0.5mA/cm latime banda si se lasa in functiune 15-20 minute, pentru omogenizare.
Aplicarea probelor:Dupa ce curentul a fost intrerupt de la butonul de oprire se scoate cadrul de extensie a benzilor si se aplica probele de cercetat.Aceasta operatie se realizeaza fie cu dispozitive speciale , fie cu ajutorul unor micropipete.Pe linia de start a fiecarei benzi (trasata initial cu un curent subtire) nominalizata anterior , se aplica 0.01-0.02 mL din solutia corespunzatoare.Probele trebuie aplicate uniform glisand usor si continuu varful pipetei pe suprafata benzii de hartie asigurand totodata un debit constant al curgerii solutiei.
Observatii:Pentru o cat mai buna rezolutie, latimea benzii continand probele de cercetat trebuie sa fie cat mai ingusta.Pentru evitarea efectului de margine , probele vor fi aplicate pe linia de start, in interior, lasand la fiecare margine a benzii, cate 0.5cm portiune libera.
Migrarea-Dispozitivul de extensie a benzilor se introduce in cuva-la fel ca mai inainte-si se fixeaza capacul.Pentru o etansare mai buna in santul in care patrund marginile capacului se introduce de jur-imprejur o cantitate suficienta de apa distilata pentru inchiderea hidraulica ,dar nu prea mare incat sa patrunda in interiorul cuvei de electroforeza.Din acest moment , intrucat urmeaza punerea in functiune a aparatului,este interzisa atingerea cuvei.Prin manivrare lenta a butonului de reglaj se stabileste intensitatea curentului la 0.5mA /cm latime banda (se iau in calcul latimile insumate ale tuturor benzilor).Durata unei astfel de separarieste cca.3 ore.Oprirea aparatului de reglaj la minimum, rotindul spre stanga si apoi inchiderea butonului de oprire.Se scoate capacul cuvei si apoi cadrul cu benzile.


Colorarea benzilor:


Cand migrarea electroforetica este terminata ,se intrerupe trecerea curentului electric prin cuva , se scot benzile si se lasa la aer 15-20 minute. Benzile sunt apoi uscate in etuva la 110 grade, timp in care proteinele sufera un proces de denaturare si fixare.
Dupa uscare benzile sunt trecute printr-o cuva cu solutie de amidoschwartz 10 B unde se tin 10 minute.
Spalarea rapida a colorantului de pe portiunile de hartie unde nu sunt proteine se face prin imersia rapida a benzilor in solutia de spalare, apoi se spala cu apa repetat , pana cand ultima baie ramane incolora.
Spalarea se poate face si numai cu apa. In acest caz apa trebuie schimbata de multe ori pana cand apa din baie nu se mai coloreaza dupa un anumit timp.Practicata in acest fel , spalarea se produce mai lent.
Benzile de hartie spalate, se usuca in spatiu deschis , la temperatura camerei.
Interpretarea rezultatelor:De o parte si alta a electoforegramei amestecului de proteine martori mentinand pozitia extremitatilor identica celei precedente din cuva.Liniile de start se aranjeaza una in prelungirea celeilalte , pe aceeasi dreapta, care serveste ca punct de referinta.Benzile din electroforegrama amestecului de proteine se compara cu benzile din electroforegramele proteinelor martori.Pe baza distantelor din centrul acestora pana la linia de start, se identifica proteinele din amestec.
Interpretarea electroforegramelor:

O electroforegrama pentru proteinele serice executata corect corespunde distributiei fractiunilor proteice in campul de migrare,pe baza mobilitatii lor electroforetice.

Evaluarea cantitativa a electroforegramelor:

Evaluarea fractiunilor proteice se realizeaza prin doua metode:
• Metoda migrarii electroforegramelor . Cu ajutorul integratoarelor se obtine o curba prin intermediul careia se calculeaza procentual fiecare proteina.
• Metoda eluarii spoturilor : spoturile sunt decupate , eluate si fotocolorimetrate.Cu extinctiile obtinute se determina continutul proteic in fiecare fractiune.
Modul de lucru: Fractiunile proteice colorate de pe electroforegrama sunt conturate cu un creion bine ascutit si decupate.Fiecare zona continand o anumita fractiune proteica se taie in portiuni mici si astfel divizata , se introduce in cate o eprubeta .Va rezulta un set de cinci eprubete , notate de la 1 la 5 ,continand fiecare o anumita fractiune proteica.
In fiecare eprubeta se pipeteaza exact , 3 mL solutie de eluare, se astupa cu dop si se lasa 30 minute in stativ.Pentru obtinerea unei mai bune eluarii, eprubetele trebuie agitate.Se determina fotocolorimetric extinctiile solutiilor celor cinci eprubete fata de eluant, la =570 nm si se calculeaza continutul procentual al fiecarei fractiuni proteice , cu ajutorul formulei:


X-continutul procentual al fiecarei proteine ; Ei-suma extinctiilor
Ex-extinctie determinata la fotocolorimetru ; 100-pentru transformarea in valori procentuale.








BIBLIOGRAFIE



• Alexandru Gioaba, Lucrari practice de biochimie - 1986 ( pag.78-81 si 111-114)
• I.Pogany, M.Banciu , Tehnica experimentala in chimia organica,
Editura stiintifica si enciclopedica, Bucuresti,1977 , (pag.361-368)
• Lehninger , Principles of Biochemistry , Worth Publishers.Inc.-1982
(pag.108,129)